Kỹ thuật chọc thủng tủy xương và sinh thiết ở loài linh trưởng không phải con người-: Tập trung vào việc ứng dụng kim sinh thiết

Các loài linh trưởng không phải con người (NHP) là động vật thí nghiệm cốt lõi cho nghiên cứu huyết học tiền lâm sàng, phát triển thuốc tế bào gốc, khám phá cơ chế miễn dịch và nghiên cứu y học chuyển giao. -chất lượng cao, mức độ nhiễm-thấp và mẫu tủy xương hoàn chỉnh là tiền đề và nền tảng của dữ liệu thực nghiệm đáng tin cậy. Chọc tủy xương và sinh thiết lõi là những kỹ thuật lấy mẫu tủy xương in vivo phổ biến nhất đối với các loài linh trưởng không phải con người. Khác với việc lấy máu tĩnh mạch thông thường, công nghệ này dựa vào kim sinh thiết rỗng cứng chuyên nghiệp để xuyên qua xương vỏ của xương dài và xương dẹt, đồng thời lấy dịch tủy xương đủ tiêu chuẩn và các mô lõi tủy xương còn nguyên vẹn từ khoang tủy. Toàn bộ hoạt động phụ thuộc nhiều vào thông số kỹ thuật hoạt động, sự phù hợp của mô hình và ứng dụng tiêu chuẩn của kim sinh thiết tủy xương. Kết hợp với các quy trình thí nghiệm trên động vật trưởng thành và kinh nghiệm tài liệu, bài viết này xây dựng một cách có hệ thống toàn bộ-thông số kỹ thuật vận hành quy trình chọc dò và sinh thiết tủy xương NHP, tập trung vào các đặc điểm chọn lọc, ưu điểm của ứng dụng và các yếu tố cần thiết trong hoạt động tiêu chuẩn hóa của kim sinh thiết chuyên dụng, nhằm cung cấp hướng dẫn kỹ thuật tiêu chuẩn hóa cho các nhà nghiên cứu thực nghiệm.

Nguyên tắc kỹ thuật cơ bản của việc chọc thủng và sinh thiết tủy xương ở các loài linh trưởng không phải người-phù hợp với hệ thống lấy mẫu tủy xương cổ điển ở chó (Crow và cộng sự, 2009). Logic cốt lõi là sử dụng kim sinh thiết rỗng cứng để xuyên qua hàng rào xương vỏ cứng, xác định chính xác khoang tủy và lấy dịch tủy xương và mẫu lõi rắn thông qua hút áp suất âm và nhúng cắt quay. Theo đặc điểm giải phẫu của NHP, các vị trí lấy mẫu phổ biến được chia thành khu vực chi trước và chi sau. Các vị trí lấy mẫu ưu tiên chi sau bao gồm mào chậu và hố chuyển xương đùi (Wolf & White, 2012), phù hợp với hầu hết các mô hình linh trưởng cỡ vừa và lớn; vị trí thay thế chi trước là củ lớn xương cánh tay, vị trí giải phẫu nông, thao tác thuận tiện, thích hợp cho việc lấy mẫu bổ sung và thí nghiệm lấy mẫu lặp lại. Các vị trí lấy mẫu khác nhau có sự khác nhau về độ dày xương, đường kính khoang tủy và độ bao phủ mô mềm, cần phải phù hợp với thông số kỹ thuật tương ứng của kim sinh thiết tủy xương để đảm bảo hiệu quả lấy mẫu và chất lượng mẫu.

Là một phẫu thuật xương xâm lấn, việc chọc dò và sinh thiết tủy xương NHP sẽ gây ra sự kích thích mô rõ ràng và phản ứng đau. Để đảm bảo phúc lợi động vật và hoạt động thí nghiệm ổn định, tất cả các hoạt động lấy mẫu phải được thực hiện dưới hình thức gây mê tiêu chuẩn. Các nhà nghiên cứu có thể chọn gây mê toàn thân hoặc gây mê nhắm mục tiêu cục bộ tùy theo chu kỳ thí nghiệm, tần suất lấy mẫu và trạng thái của từng động vật để đạt được đủ mức độ giảm đau trong và sau phẫu thuật. Ngoài ra, toàn bộ quy trình phải tuân thủ nghiêm ngặt các thông số kỹ thuật thí nghiệm vô trùng, bao gồm cạo râu trước phẫu thuật và chuẩn bị da cho khu vực lấy mẫu, khử trùng-tiêu chuẩn đa tiêu chuẩn bằng povidone-i-ốt và cồn, trải khăn vô trùng, đeo găng tay và dụng cụ phẫu thuật vô trùng để tránh nhiễm trùng cục bộ, viêm vết thương và các biến chứng sau phẫu thuật khác ảnh hưởng đến các thí nghiệm lặp lại sau đó một cách hiệu quả.

Ưu điểm của phân loại, lựa chọn và hiệu quả của kim sinh thiết tủy xương đặc biệt

Kim sinh thiết tủy xương là công cụ chính xác cốt lõi của việc lấy mẫu tủy xương NHP, xác định tỷ lệ thành công của một-lần đâm thủng, tính nguyên vẹn của mẫu xét nghiệm và mức độ nhiễm bẩn máu ngoại vi. Hiện tại, có nhiều mẫu kim lấy mẫu tủy xương đặc biệt đã được thương mại hóa hoàn thiện dành cho động vật thí nghiệm, bao gồm kim Rosenthal, Klima, kim xương ức/chậu Illinois và kim Jamshidi. Mỗi mẫu có thiết kế khác biệt về chiều dài kim, đường kính đo, cấu trúc lõi bên trong và tay cầm cầm tay, thích ứng với các loại cơ thể động vật khác nhau, đặc điểm giải phẫu xương và mục đích lấy mẫu thử nghiệm.

Trong số tất cả các loại kim,Kim sinh thiết tủy xương Jamshidi 14Glà tiêu chuẩn vàng cho sinh thiết lõi tủy xương NHP, đây là thông số kỹ thuật được khuyên dùng nhiều nhất cho các hoạt động thử nghiệm. Loại kim sinh thiết này sử dụng cấu trúc rỗng cứng nhắc được tối ưu hóa, với kim định hình rắn ở trung tâm phù hợp. Thân kim có độ cứng và độ dẻo dai vừa phải, có thể xuyên qua xương vỏ của loài linh trưởng một cách hiệu quả mà không bị cong hay trượt. Lưỡi cắt xoắn ốc ở đầu kim có thể nhúng và chặn các mô lõi tủy xương hoàn chỉnh một cách ổn định, tránh tình trạng phân mảnh mẫu và tổn thương đùn mô do các loại kim không chuyên nghiệp gây ra. So với kim hút có đường kính-mỏng, kim sinh thiết 14G Jamshidi có đường kính khoang bên trong lớn hơn, có thể lấy đủ-các mẫu lõi thể tích mà vẫn đảm bảo an toàn, đáp ứng nhu cầu phát hiện hình thái, cắt mô và phân tích chỉ số thực nghiệm của sinh thiết lõi. So với kim dày quá khổ, nó có thể làm giảm chấn thương xương quá mức và chảy máu trong khi phẫu thuật một cách hiệu quả, cân bằng chất lượng mẫu vật và khả năng sử dụng lặp lại của động vật.

Tất cả các kim sinh thiết tủy xương đặc biệt đều được thiết kế với một kim định hình trung tâm phù hợp, đây là đặc điểm cấu trúc chính khác với kim tiêm thông thường. Ống thông có thể chặn hoàn toàn khoang rỗng của thân kim trong quá trình đâm thủng, ngăn mô mềm da và các mảnh vụn xương xâm nhập vào khoang kim để chặn đường ống, đồng thời đảm bảo quá trình hút áp suất âm và cắt mô lõi tiếp theo diễn ra suôn sẻ. Trong các thí nghiệm lấy mẫu lặp lại, các nhà nghiên cứu cần chọn thông số kỹ thuật của kim theo trọng lượng cơ thể và kích thước xương của động vật: kim sinh thiết cỡ ngắn và nhỏ- dành cho các loài linh trưởng nhỏ (trọng lượng cơ thể dưới 5kg) và kim Jamshidi có chiều dài trung bình 14G-thông thường dành cho cá thể vừa và lớn, giúp thực hiện việc kết hợp chính xác giữa thiết bị và đối tượng thí nghiệm.

Các biện pháp phòng ngừa chính trước phẫu thuật khi lấy mẫu kim sinh thiết

Để tránh đông máu, tan máu và ô nhiễm mẫu, đồng thời cải thiện tỷ lệ mẫu thí nghiệm đủ tiêu chuẩn, phải thực hiện các thông số kỹ thuật về tiền xử lý và vận hành tiêu chuẩn cho kim sinh thiết trước khi lấy mẫu. Đầu tiên,tiền xử lý chống đông máu bằng heparin cho kim và ống tiêmlà bắt buộc. Trước khi sử dụng, chiết một lượng nhỏ dung dịch heparin để xả thành trong của kim sinh thiết và ống tiêm phù hợp, đồng thời xả hết chất lỏng còn sót lại, tạo thành một lớp phủ chống đông máu heparin đồng nhất trên thành trong của khoang kim. Thao tác này có thể ngăn chặn một cách hiệu quả tình trạng đông máu nhanh chóng của dịch tủy xương sau khi lấy mẫu, tránh thất bại trong việc chuẩn bị phết tế bào và phát hiện tế bào do đông máu mẫu gây ra và là bước tiền xử lý quan trọng để thu được dịch tủy xương-chất lượng cao.

Thứ hai, đối với các thử nghiệm lấy mẫu động vật lặp đi lặp lại-trong thời gian dài,lựa chọn luân phiên các vị trí đâm thủngnên được áp dụng để tránh đâm thủng nhiều lần tại một vị trí, điều này có thể dẫn đến tăng sản xương vỏ, bám dính mô cục bộ và tăng khả năng chống đâm thủng, dẫn đến thất bại trong việc lấy mẫu và tăng chấn thương cho động vật. Về phương pháp giảm đau, tiêm thuốc giảm đau cục bộ vào da và mô mềm sâu của vị trí đâm thủng tốt hơn so với gây mê toàn thân đơn giản, có thể làm giảm đau nhức và khó chịu vết thương sau phẫu thuật một cách hiệu quả, giảm phản ứng căng thẳng của động vật và tạo điều kiện phục hồi sau phẫu thuật và các thí nghiệm lặp lại tiếp theo.

Về mặt kiểm soát thể tích lấy mẫu, bị giới hạn bởi dung tích khoang kim của kim sinh thiết và thể tích máu sinh lý của động vật thí nghiệm, thể tích lấy mẫu của một vị trí đâm thủng không được vượt quá 2mL. Chiết xuất quá mức sẽ dẫn đến pha loãng máu ngoại vi nghiêm trọng, làm giảm tỷ lệ tế bào có nhân và mô tủy xương hoạt động trong mẫu vật, cản trở kết quả phát hiện thực nghiệm và ảnh hưởng đến độ chính xác của phân tích chỉ số huyết học và quan sát hình thái mô.

Quy trình phẫu thuật tiêu chuẩn cho chọc thủng mào chậu (Phẫu thuật sinh thiết lõi bằng kim)

Iliac crest là địa điểm lấy mẫu thông thường và được ưa thích nhất để-sinh thiết tủy xương linh trưởng, với xương vỏ dày, mô tạo máu khoang tủy phong phú và một số cơ quan quan trọng lân cận, có độ an toàn cao và tỷ lệ lấy mẫu thành công cao. Sau khi con vật được gây mê hoàn toàn, đặt con vật ở tư thế nằm sấp, gập hai chi dưới dưới bụng để nâng xương hông lên và để lộ toàn bộ khu vực lấy mẫu mào chậu. Hầu hết các loài linh trưởng không phải con người đều có lông thưa ở vùng mào chậu nên chỉ cần cạo đơn giản và làm sạch da. Da được khử trùng xen kẽ bằng povidone-iốt và cồn, đồng thời trải một chiếc khăn có lỗ vô trùng để cách ly khu vực phẫu thuật và đảm bảo thao tác vô trùng.

Sau khi xác định ranh giới mào chậu bằng cách sờ nắn, dùng dao phẫu thuật vô trùng rạch một đường da nhỏ ở mặt trước của mào chậu để giảm lực cản ma sát của kim sinh thiết trong quá trình đâm xuyên. Căn chỉnh kim sinh thiết Jamshidi 14G với vết mổ, tiến từ từ đến mép sau trước của mào chậu, giữ thân kim luôn vuông góc với mặt phẳng mào chậu và tạo áp lực hướng xuống liên tục và ổn định trong khi xoay thân kim theo chiều kim đồng hồ. Tư thế chèn kim thẳng đứng là chìa khóa để sinh thiết thành công, có thể đảm bảo rằng đầu kim đi vào khoang tủy chính xác, tránh sự xâm nhập xiên dẫn đến tách xương vỏ và tổn thương mô lân cận, đồng thời tối đa hóa hiệu suất cắt và lấy mẫu của đầu kim sinh thiết.

Khi thân kim xuyên qua xương vỏ, người thực hiện rõ ràng sẽ cảm nhận được khả năng chống xuyên thấu giảm đột ngột và kim sinh thiết có thể cố định ổn định trong mô xương mà không bị rung, cho thấy đầu kim đã đi vào khoang tủy thành công. Lúc này, rút ​​hoàn toàn ống dẫn khí trung tâm ra, nối ống tiêm vô trùng 10mL vào đuôi kim sinh thiết và tạo áp suất âm ổn định bằng cách kéo pít-tông. Tủy xương linh trưởng tươi có màu đỏ sẫm và sủi bọt, có độ nhớt cao hơn máu ngoại vi và chứa các mô xương bèo nhỏ màu sáng, là mẫu tủy xương đủ tiêu chuẩn.

Nếu không rút được dịch tủy xương, đừng rút thân kim ra một cách mù quáng. Xoay kim sinh thiết 90 độ –180 độ để điều chỉnh phạm vi cắt và lấy mẫu của đầu kim; nếu vẫn không hợp lệ, hãy lắp lại stylet, điều chỉnh một chút độ sâu của thân kim về phía trước hoặc phía sau và tạo lại áp lực âm. Đối với các mẫu thí nghiệm chẩn đoán, thể tích lấy mẫu của một địa điểm được kiểm soát trong phạm vi 1mL để đảm bảo độ tinh khiết của mẫu; nếu cần một lượng lớn mẫu tủy xương để làm thí nghiệm thì chọn nhiều vị trí đâm để lấy mẫu thay vì chiết quá nhiều ở một vị trí. Sau khi lấy mẫu, nhanh chóng rút kim sinh thiết ra, nén cầm máu trực tiếp lên vị trí đâm thủng trong thời gian dài và khâu da bằng chỉ đơn nếu xảy ra chảy máu dai dẳng.

Phẫu thuật chọc thủng và sinh thiết hố trochanteric xương đùi và đầu gần xương cánh tay

Hố mấu chuyển xương đùi là nơi lấy mẫu bổ sung lý tưởng cho các loài linh trưởng nhỏ không phải con người-(trọng lượng cơ thể<5kg). The local bone structure is shallow, and the medullary cavity is concentrated, which is convenient for the positioning and penetration of fine-gauge biopsy needles. However, the proximal thigh muscle layer of large primates is thick, resulting in large puncture resistance and difficult operation. The core operation principle is consistent with iliac crest biopsy: place the animal in lateral position, hold the proximal thigh with the palm, locate the trochanteric fossa at the inner and distal side of the femoral greater trochanter by thumb palpation, insert the biopsy needle toward the femoral shaft to penetrate into the medullary cavity, and complete negative pressure aspiration and specimen collection according to the standard needle operation procedure.

Đầu gần xương cánh tay là một vị trí lấy mẫu thay thế hiệu quả khác. Đường kính xương dài cánh tay lớn hơn, khoang tủy rộng hơn và nông hơn giúp việc định vị kim sinh thiết chính xác hơn và thao tác đơn giản hơn. Đặt con vật ở tư thế nằm nghiêng, giữ đầu gần chi trước, sờ nắn rãnh giữa các củ lớn và củ nhỏ, đưa kim sinh thiết về phía thân xương cánh tay để đi vào khoang tủy. Địa điểm này có yêu cầu thấp về độ chính xác của thân kim, tỷ lệ thất bại do đâm thủng thấp và phù hợp để lấy mẫu nhanh và thí nghiệm trên động vật hàng loạt.

Ứng dụng chuyên sâu về phương pháp truyền dịch xương dài và sinh thiết lõi bằng kim-

Khác với phương pháp đâm kim đơn{0}}thông thường, phương pháp truyền dịch qua xương dài (Kushida và cộng sự, 2000) là một công nghệ lấy mẫu tủy xương có độ tinh khiết cao-thích hợp cho các thí nghiệm có độ chính xác-cao, đòi hỏi phải sử dụng phối hợp hai kim sinh thiết tủy xương. Phẫu thuật cần lần lượt đưa các kim sinh thiết phù hợp vào khoang tủy ở cả hai đầu của trục xương dài, tiêm từ từ nước muối sinh lý vô trùng thông qua một kim sinh thiết và thu thập tủy xương-có chứa dịch thấm vào hộp kín vô trùng thông qua ống mở rộng nối với kim còn lại. Chế độ lấy mẫu hợp tác hai kim-này tránh được hiệu quả tình trạng nhiễm bẩn máu ngoại vi trong phương pháp chọc dò thông thường và các mẫu tủy xương thu được có độ tinh khiết cao hơn, phù hợp cho việc tách tế bào gốc, nuôi cấy in vitro và các thí nghiệm phát hiện omics có độ chính xác-cao.

Phân biệt hoạt động hút tủy xương và sinh thiết lõi dựa trên kim sinh thiết

Khát vọng tủy xương và sinh thiết lõi có cùng vị trí lấy mẫu và thiết bị kim sinh thiết, nhưng logic thao tác kim sau phẫu thuật hoàn toàn khác nhau, điều này quyết định hai loại mẫu thí nghiệm: dịch tủy xương lỏng và mô lõi tủy xương rắn. TRONGhút tủy xương, sau khi kim sinh thiết được cố định trong khoang tủy, rút ​​ống thông và nối ống tiêm để tạo áp suất âm để chiết ra dịch tủy xương lỏng, dùng để đếm tế bào, phết tế bào hình thái và phát hiện tế bào học dòng chảy.

TRONGsinh thiết lõi tủy xươngtập trung vào các mẫu mô, sau khi rút kim ra, kim sinh thiết Jamshidi tiến sâu hơn 1–2cm vào khoang tủy thông qua áp suất ổn định và quay chậm. Lưỡi cắt xoắn ốc ở đầu kim có thể bọc hoàn toàn mô lõi tủy xương. Sau đó nới lỏng thân kim bằng cách xoay và lắc, rút ​​nhẹ và lắp lại để tách phần dưới của mô lõi ra khỏi bè xương. Sau khi xác nhận rằng mô đã được tách hoàn toàn, hãy rút kim sinh thiết ra bằng lực kéo quay. Cuối cùng, đẩy mẫu lõi tủy xương rắn còn nguyên vẹn ra khỏi khoang kim bằng dụng cụ đẩy tuyến tính và cố định bằng 10% formalin để cắt mô và phân tích bệnh lý.

Phần kết luận

Ứng dụng tiêu chuẩn của kim sinh thiết tủy xương là chìa khóa cốt lõi dẫn đến sự thành công của các thí nghiệm sinh thiết và chọc thủng tủy xương linh trưởng không phải là con người. Kim sinh thiết 14G Jamshidi, với thiết kế cấu trúc được tối ưu hóa và hiệu suất lấy mẫu ổn định, là thiết bị được ưu tiên dùng cho sinh thiết lõi NHP. Các nhà nghiên cứu cần lựa chọn thông số kỹ thuật của kim theo loại cơ thể động vật và mục đích thí nghiệm, thực hiện nghiêm ngặt các quy trình tiền xử lý bằng heparin, vận hành vô trùng và xoay vòng vị trí, đồng thời nắm vững các kỹ thuật vận hành khác biệt của hút và sinh thiết lõi. Việc lựa chọn và vận hành kim được tiêu chuẩn hóa có thể cải thiện một cách hiệu quả độ tinh khiết và tính toàn vẹn của mẫu, giảm chấn thương ở động vật và sai sót trong thí nghiệm, đồng thời cung cấp hỗ trợ kỹ thuật vững chắc cho nghiên cứu huyết học tiền lâm sàng và y học tịnh tiến dựa trên mô hình linh trưởng không phải của con người.